双功能基因APE1敲低后人体骨肉瘤细胞基因表达谱变化的研究[1]

2007年1月ACTA　ACADEMIAE　MEDICINAE　MILITARIS　TERTIAEJan.2007

1

文章编号:100025404(2007)0120001204

论著

2

1

3

双功能基因APE1敲低后人体骨肉瘤细胞基因表达谱变化的研究

王　东

2

1,2

,仲召阳

1,2

,李增鹏,杨镇洲,MarkRKelley　　(第三军医大学大坪医院野战外科研究所:1肿瘤中心,

病理科,重庆400042;3美国印地安纳大学医学院,印地安纳46202)

　　提　要:目的　探索APE1敲低后骨肉瘤细胞恶性表型受抑的可能机制,以及APE1相互作用的可能分子。方法　应用免疫印迹和AP核酸内切酶活性检测确证合成APE1siRNA对人体骨肉瘤细胞HOSAPE1基因的敲低作用;应用GEAr2TMrayQ系列cDNA微阵列研究HOS细胞APE1敲低后基因表达谱的改变。结果　APE1siRNA对HOS细胞APE1基因具有特异性“敲低”作用,其抑制效率为91.5%。APE1抑制对cDNA微阵列六族途径均有影响,其中对细胞周期族基因影响较少;96个基因中有42个基因有明显变化(43.8%),其中CDK4、FGFR2、KAI1和NCAM1表达上升,其余38个基因表达均呈下降。结论　APE1的敲低对骨肉瘤细胞的细胞周期及DNA损伤、细胞凋亡、信号转导、细胞黏附、血管生成、肿瘤转移途径基因均有影响。　　关键词:骨肿瘤;RNA干扰;脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶;基因微阵列　　中图法分类号:R394233;R394.3;R738.1　　　文献标识码:AThealteredgeneprofileofhumanosteosarcomacellafterknock2downofdoublefunctionalgeneapurinic/apyrimidinicendonuclease

1,21,2213WANGDong,ZHONGZhao2yang,LIZeng2peng,YANGZhen2zhou,MarkRKelley(1CancerCenter,2Department

ofPathology,InstituteofSurgeryResearch,DapingHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042,China;WellCenterforPediatricResearch,IndianaUniversitySchoolofMedicine,Indianapolis,Indiana46202,USA)

3

HermanB

　　Abstract:Objective　Toexplorethemolecularmechanismofinhibitedmalignantphenotypebyknock2

downofapurinic/apyrimidinicendonuclease(APE1)inhumanosteosarcomacellHOS,aswellasthepossibleinteractingmoleculesamongAPE1.Methods　Knock2downofAPE1bysynthesizedAPE1siRNAinHOScellwasidentifiedfirstbyWesternblottingandAPendonucleaseassay,thenthegeneprofilewasdeterminedwith

TM

GEArrayseriesHumanCancerPathwayFindergenearray.Results　Thespecificknock2downofAPE1wasfoundinHOScelltransfectedwithAPE1siRNA,anditsinhibitedratewas91.5%.SixbiologicalpathwaysofthegenearraywereinvolvedinHOScellafterknock2downofAPE1,butthecellcyclepathwaywaslessinflu2enced.Forty2twooutof96geneswerealtered(43.8%),inwhichonlyCDK4,FGFR2,KAI1andNCAMwereincreased,38othersweredecreased.Conclusion　Theknock2downofAPE1wasdetectedtobeinvolvedinallthepathwaysincludingcellcycleandDNArepair,apoptosis,signaltransduction,adhesion,angiogene2sis,invasionandmetastasis.ThesefindingsaresignificanttofurtherelucidateAPE1roleintumorgenesisandtoprovideexperimentalevidenceforgenetherapytargetingAPE1geneinthefuture.　　Keywords:bonetumor;RNAinterference;APE1;genearray　　无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶(apurinic/apyrimidinicendonudease,APE1),又称氧还因子Ref21(redoxfac2

[1]

tor21),是一个具有双功能的蛋白。APE12个功能分别位于2个分立的功能域,N2端(约127aa)呈现氧还活性,C2端(约157aa)则起DNA修复功能。2个功

　　基金项目:国家自然科学基金(30340044,30472004),第三军医大学校管基金

(XG200357)　　　　　　SupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(30340044,

30472004)andtheScientificResearchFundsbyThirdMilitaryMedi2

calUniversity(XG200357)

能域可以人为地分开而各自发挥作用,但对哺乳动物

[2]

细胞的存活两者则是绝对不可缺少的。RNA干扰(RNAi)是新近发展的一种转录后基因沉默技术,应用该技术敲低(knock2down)APE1的蛋白表达表现为凋亡增加,对放疗和细胞毒性化疗药物敏感性增加以及

[3-5]

诱导内皮细胞迁移和肿瘤血管生成受抑。为了探索上述骨肉瘤恶性表型受抑的可能机制,以及APE1相互作用的可能分子,我们应用cDNA微阵列技术研究人骨肉瘤细胞APE1敲低后分子表达谱的改变。1　材料与方法1.1　细胞培养

　　人骨肉瘤细胞株HOS源于ATCC细胞库,含10%胎牛血

　　作者简介:王　东(1964-),男,天津市人,博士,主任医师,教授,主要从事

肿瘤DNA损伤修复及基因治疗方面的研究,发表论文50余篇。

电话:(023)68757706,E2mail:dongwang64@hotmail.com

　　收稿日期:2006202217;修回日期:2006203211

2　　　　　　　　　　　第　三　军　医　大　学　学　报　　　　　　　　　　　　第29卷

细胞APE1蛋白表达明显抑制(抑制效率为91.5%),同时APE1核酸内切酶活性也随之降低(图2)。结果证实本研究合成的APE1siRNA能够发挥RNA干扰作用,有效敲低APE1表达,该细胞适用于下一步研究APE1抑制后HOS细胞基因表达谱的变化。

清(HycloneLaboratories,UT),2mmol/LL2谷氨酰胺,0.1mmol/L非必需氨基酸,1.0mmol/L丙酮酸盐,100U/L青

α培养基(InvitrogenCA),5%霉素2100μg/L链霉素的MEM

CO2,37℃孵育。

1.2　APE1siRNA转染

　　参照Wang设计的APE1siRNAcDNA序列合成双链siRNA(DharmaconResInc,Lafayette,CO),并根据说明进行去保护和水化。APE1双链siRNA的序列为:5′2GUCUG2

GUACGACUGGAGUACC23′;5′2UACUCCAGUCGUACCAGACCU23′;无义对照双链siRNA的序列为:5′2CCAUGAGGUCAG2CAUGGUCUG23′;5′2GACCAUGCUGACCUCAUGGAA23′。将

5处于对数生长期的HOS细胞浓度调整为1×10/ml,选5ml接

[3]

种于6孔培养板中培养过夜。10mmol/LHepes缓冲液将双链siRNA稀释至100μl,以1∶2比例加入OptimenⅠ(总体积为200μl),室温放置15min。随后加入PBS洗涤过的待转染细A:转染APE1siRNA48h后HOS细胞APE1蛋白表达抑制B:APE1蛋白表达抑制灰度密度分析结果

胞中,37℃,5%CO2,饱和湿度培养4～8h,更换新鲜培养液继续培养。双链siRNA的终浓度分别为50、100、200nmol/L。

图1　APE1蛋白印迹结果

1.3　免疫印迹

7　　收集细胞,PBS洗涤2次,按1×10细胞加入100μl细胞

裂解液,低温12000r/min离心10min,取上清液加入2×SDS凝胶加样缓冲液沸水煮沸5min,取上清测定蛋白浓度,用12%聚丙烯酰胺凝胶分离。转PVDF膜,先后加入兔抗人APE1抗体(1∶2000)和鼠抗β2actin抗体(1∶1000);加入二抗:3%BSA

40ml+抗兔HRP2IgG8μl(工作浓度为1∶5000),同时加入3%BSA40ml+抗鼠HRP2IgG16μl,室温反应1h,洗膜显影。Image2proplus4.5图像分析系统测定各条带灰度值。

1.4　AP核酸内切酶活性检测

　　AP酶反应底物为中间含有THF残基的26个碱基单链寡核苷酸及互补链(UniversityofIowa),HEX2ATP5′2末端标记后退火形成双链寡核苷酸[6];当存在AP核酸内切酶时,即可产生HEX标记的13mer寡核苷酸片段;收集细胞,超声破碎提取蛋白,Bradford法蛋白定量(Bio2RdInc)。反应体积20μl,含

0～1μg蛋白提取物,0.2pmolHEX标记的底物和反应缓冲

A:无义对照;B:APE1siRNA

1:1μg;2:0.5μg;3:0.1μg;4:0.05μg

图2　转染APE1siRNA48h后HOS细胞APE1核酸内切酶活性

显著抑制

2.2　cDNA微阵列杂交分析

　　本实验应用GEArrayTMQ系列“肿瘤途径结果显示(cancer

pathwayfinder)”cDNA微阵列。它包含细胞周期与DNA修复、细胞凋亡、信号转导、细胞黏附、血管生成、肿瘤转移六族共计

96个基因。APE1siRNA转染HOS细胞48h后,cDNA阵列杂

液;37℃孵育15min,甲酰胺终止反应,凝胶电泳显像。

1.5　cDNA阵列分析

　　100nmol/LAPE1双链siRNA处理HOS细胞48h,应用

Trizol(Invitrogen)分别提取处理组和对照组细胞总RNA,TruL2

abeling2AMP试剂盒(SuperArrayBioCo)合成生物素标记UTP

交结果见图3。

的cRNA,按照GEArrayTMQ系列试剂盒(SuperArrayBioCo)说明进行预杂交、杂交和X光胶片显像。

1.6　数据处理

　　IDEA软件(SuperArrayBioCo)进行结果分析,具体步骤按说明进行。上述实验重复2次以减少结果误差,变化倍数2界定为显著影响,5为极显著影响。

2　结果

2.1　APE1siRNA抑制APE1蛋白表达及核酸内切酶

活性

　　如图1所示,APE1siRNA转染48h后,免疫印迹显示HOS

A:对照组;B:APE1siRNA转染48h后

图3　人体骨肉瘤细胞GEArrayTMQ系列“肿瘤途径发现”cDNA

微阵列杂交显像结果

第1期　王　东,等.双功能基因APE1敲低后人体骨肉瘤细胞基因表达谱变化的研究　

3

　　应用IDEA软件进行分析结果如表1所示。APE1抑制对六族途径均有影响,其中对细胞周期族基因影响较小;96个基

因中有42个基因有明显变化(43.8%),其中CDK4、FGFR2、

KAI1和NCAM1表达上升,其余38个基因表达均呈下降;以2

倍变化界定为影响显著,其中CDK4、NFKBIA、CD44、MICA、EG2

β1、βR1、FR、TGFTGFTHBS1、SERPINE1和TIMP1变化倍数超过5倍(10/42),为影响最为显著者。

表1　人体骨肉瘤细胞APE1抑制后基因谱的变化

基因途径细胞周期

1520

AKT1ATMCDK4

2.1362.310

12.930

名称降低升高基因途径细胞黏附

17364446名称降低升高

CD44ICAM1ITGA4ITGA6ITGB1MICANCAM1

6.8634.0262.6342.4233.6047.654

3.101

细胞凋亡

489132456737791

APAF1BCL2BCL2L1CASP8CFLARMDM2PRKDCRB1

2.4132.4632.1912.7713.0313.0412.1013.663

486163

血管生成

283132406785

EGFRFGF2FGFR2IL28PDGFA

2.9432.0617.416.1413.017

2.846

TNFRSF10B3.206

信号转导

2654556465697075

CTNNB1MAP2K1MAPK14NFKB1NFKBIAPIK3CBPIK3R1RAF1

2.3142.4602.6542.6265.7934.5212.6023.146

β1TGF

8687

βR112TGF.098THBS1

11.831

肿瘤转移

5260668189

KAI1MTA1NME4

2.1043.016

3.164

SERPINE15.421TIMP1

12.466

3　讨论

　　APE1敲除研究表明,APE1小鼠可以正常发

-/-育,而APE1小鼠在胚胎期5.5d就出现不正常发

[7]

育,于着床后不久死亡。这充分证明了APE1蛋白在正常生长中是必不可少的。在进化中APE1非常保守,甚至植物拟南芥(arabiodopsisthaliana)的无嘌呤/无嘧啶内切酶Arp也可以还原人的Fos/Jun,这从另一方面反映了APE1在生命长河中所处的重要地位。　　APE1为DNA碱基切除修复途径的限速酶,是细胞DNA放射性损伤和烷化剂致伤重要的修复因子,具有与碱基切除修复有关的AP核酸内切酶和32磷酸二酯酶活性的多功能酶。此外,APE1通过氧原功能,能

κ够还原一些氧原敏感的转录因子,如AP21、NF2B、P53

-/+

等的DNA结合功能域中关键胱氨酸的硫基,并活化它

[1]

们的DNA结合与转录激活能力。研究与APE1相互作用的蛋白质对揭示APE1的功能,调控有着深远

[8]

的意义。Hirota等的研究表明硫氧还蛋白TRX与APE1相互作用,提示细胞内存在氧还调控级联;Ku抗原也可与APE1相互作用。说明DNA激活蛋白对

[9]

DNA元件的专一性识别可被氧还调控机制改变。

[10]

应用酵母双杂交和凝胶泳动变位技术,Bennett等证实APE1和DNA多聚酶β相互结合,共同作用于

[11]

DNA碱基切除修复途径。严明达等应用APE1氧还功能域进行了酵母双杂交库的筛选,在5种阳性克隆中其一经测序证实为泛蛋白连接酶ubc9,表明ubc9参与了Ref21的蛋白降解。热休克蛋白70(HSP70)是

[12]

参与多种蛋白质活动的重要伴侣分子。Kenny等应用免疫共沉淀方法发现HSP70可以与APE1相结合,而且能显著提高APE1与DNA损伤AP位点的结合以及其核酸内切酶的活性。　　应用RNAi技术敲低APE1蛋白表达,骨肉瘤细胞表现为凋亡增加,对放疗和细胞毒性化疗药物敏感性增加以及诱导内皮细胞迁移和肿瘤血管生成受抑等表型。为了探讨APE1作用的可能分子机制,我们应用cDNA微阵列技术研究人骨肉瘤细胞APE1敲低后分子表达谱的变化。首先,通过蛋白印迹和核酸内切酶活性检测证实本研究合成的APE1siRNA能够发挥RNA干扰作用,有效地敲低APE1表达,该细胞适用于下一步研究HOS细胞基因表达谱的变化。进而,我们

TM

应用GEArrayQ系列“肿瘤途径发现(cancerpathwayfinder)”cDNA微阵列。它包含细胞周期、细胞凋亡、信号转导、细胞黏附、血管生成、肿瘤转移六族共计96个基因。结果表明APE1抑制对六族途径均有影响,其中对细胞周期族基因影响较小;96个基因中有42个基因有明显变化(43.8%),其中CDK4、FGFR2、KAI1和NCAM1表达上升,其余38个基因表达均呈下降;以2倍变化界定为影响显著,其中CDK4、NFKBIA、

β1、TGFβR1、THBS1、SER2CD44、MICA、EGFR、TGF

PINE1和TIMP1变化倍数超过5倍(10/42),为影响最为显著者。由此可见,双功能基因APE1的敲低对骨肉瘤细胞分子途径具有比较广泛的影响。但哪些作用是间接的、哪些是直接的,仍需要今后深入的研究。我们过去的研究表明敲低APE1可显著抑制骨肉瘤细

[4]

胞诱导的内皮细胞迁移。本实验结果显示APE1敲低对VEGF的表达影响不明显,但对其他血管生成相

β1和TGFβ1受体却有显著的抑关因子如EGFR、TGF

制作用。APE1敲低对细胞黏附和转移中多个基因亦有抑制作用,提示APE1基因对肿瘤的侵袭和转移可

4

第29卷第1期第　三　军　医　大　学　学　报Vol.29,No.1

2007年1月ACTA　ACADEMIAE　MEDICINAE　MILITARIS　TERTIAEJan.2007

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regulatedbyadirectassociationbetweenthioredoxinandRef21[J].ProcNatlAcadSciUSA,1997,94(8):3633-3638.

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能有重要作用。上述结果为今后深入研究APE1在肿

瘤中的作用,以及以APE1为靶点的肿瘤基因治疗有着重要的指导意义。参考文献:

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[4]王　东,仲召阳,李增鹏,等.pSilenceAPE1对骨肉瘤诱导血管内皮细胞迁徙抑制作用的实验研究[J].第三军医大学学报,2006,

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[5]仲召阳,王　东,向德兵,等.pSilenceAPE1抑制骨肉瘤生长的

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[6]KreklauEL,Limp2FosterM,LiuN,etal.Anovelfluorometricoligo2

nucleotideassaytomeasureO(6)2methylguanineDNAmethyltrans2ferase,methylpurineDNAglycosylase,82oxoguanineDNAglycosylase

(编辑　龙　亮)

个案与短篇

宫腔镜与气囊导尿管在宫腔黏连致不孕治疗中的联合应用

袁超燕　　(湖北民族学院医学院附属医院妇产科,恩施445000)

　　宫腔黏连(intrauterineadhesion,IUA)指经宫腔手术操作或因放射、感染造成子宫内膜破坏引起宫壁相互黏连而出现的一系列临床病变,包括腹痛、闭经、月经过少或流产、不孕等现象[1]。其发病率逐年增加是引起不孕的重要原因,占不孕症

[2]

40%(Sirbu,1957)。虽然我院多年来对宫腔黏连的患者采用分离黏连后上节育环,但对不孕症患者需再次宫腔操作取出节育环,增加了宫腔操作的次数及对子宫内膜的损伤。自2004年

5月以来我们对宫腔黏连致不孕患者采用宫腔镜下分离黏连后

文章编号:100025404(2007)0120004201

例,年龄最大37岁,最小25岁,平均28.5岁。其中来源于人流术后15例,药流不全刮宫1例,产褥期胎盘黏连多次刮宫2例,慢性宫颈炎2例,急性内膜炎1例。

　　临床表现:其中周期性腹痛5例,占23.8%,月经量减少7例,占33.3%,闭经14例,占66.7%,ΗSG检查术中发现颈管黏连3例,占14.3%,宫腔黏连18例,占85.7%。超声提示宫腔内液性暗区3例,占14.3%。

1.2　方法

　　患者均常规查血糖、心电图及白带后用0.2‰碘伏棉球擦洗阴道3d。术前禁食水4h,肌注术前针,静脉推注安定

10mg、肌注度冷丁50mg。常规消毒铺巾,先用探针分离黏连

上气囊导尿管扩张宫腔的方法,使患者术后恢复正常月经周期,改善妊娠条件和提高生育功能,取得良好的效果,现报告如下。

1　资料与方法1.1　一般资料

　　选取2004-2005年外院共收治宫腔部分黏连致不孕21

　　作者简介:袁超燕(1969-),女,湖北省恩施市人,副主任医师,副教授,主要

从事妇科肿瘤及不孕不育方面的研究,发表论文16余篇。电话:(0718)8221842

的宫颈管,再用6～7mm扩宫棒扩宫,让宫腔积血流出,然后用宫腔镜检查。宫腔镜进入宫腔后,先观察宫腔形态,然后依宫底、前壁、后壁、侧壁的顺序检查宫腔,了解黏连部位、程度,接着在宫腔镜下分离黏连,待宫腔黏连分离完毕后可见双侧输卵管开口。术毕放置8号气囊导尿管,气囊中注入生理盐水3～

5ml,导尿管外端接引流袋,2周后拔除导尿管。

　　收稿日期:2006203214;修回日期:2006205222

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