紫外分光光度法测定蛋白质含量

一、实验目的

1.学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。 2.掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术。

3.掌握TU-1901紫外-可见分光光度计的使用方法并了解此仪器的主要构造 二、实验原理

本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量。蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键。因此，蛋白质具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于280 nm附近（不同的蛋白质吸收波长略有差别）。在最大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液的浓度的关系服从朗伯-比耳定律。

三、实验仪器与试剂

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TU-1901紫外-可见分光光度计，比色管，吸量管 标准蛋白质溶液：3.00 mg.mL溶液 0.9% NaCl溶液，待测蛋白质溶液 （牛血清白蛋白） 四、实验操作与步骤 1. 标准曲线的制作 ：

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用吸量管分别吸取1.0 、1.5、 2.0 、2.5 、3.0 mL 3.00 mg.mL标准蛋白质溶液于5只10 mL 比色管中，用0.9% NaCl溶液稀释至刻度，摇匀。用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液为参比，在280 nm处分别测定各标准溶液的吸光度A280，记录所得读数。

由吸收曲线得出最大吸收波长为278nm。

Abs3.02.52.01.51.00.50.0-0.5200300400Abs波长 (nm)

2. 样品测定：

取待测蛋白质溶液3 mL，按上述方法测定280 nm处的吸光度。平行测定三份。 五、数据处理

1. 以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

2. 根据样品溶液的吸光度，从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度。

待测样品3mL 10mL 试验次数 吸光度 1 0.499 2 0.500 3 0.501 带入y=0.59533x+0.136得

C1=0.6097； C2=0.6114；C3=0.6131. C平均=（0.6097+0.6114+0.6131）/3=0.6114 Cx=0.6114x10/3=2.038mg/mL 标准偏差为：S=

21/2

｛［（0.6097-0.6114）+(0.6114-0.6114)2+(0.6131-0.6114)2］/2｝x10/3=0.0057

相对标准标差为：RSD=S/Cxx100%=0.0057/2.038x100%=0.28% 七、问题及讨论

1．若样品中含有核酸类杂质，应如何校正？

答：优点：紫外吸收法测定蛋白质含量易于操作、快速，消耗样品量少。

缺点：是容易被核酸干扰，准确度较差；对测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量较大的蛋白质，有一定的误差，若伴有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，会产生较大的干扰；本实验是测量的样品是纯蛋白质溶液。

2.因为核酸在260nm处的光吸收比280nm更强，但蛋白质却恰恰相反，因为此可利用280及260nm的吸收差来计算蛋白质的含量。常用下列经验公式计算：

蛋白质浓度（mg/mL）=1.45A280-0.74A260

（A280和A260分别为蛋白质在280nm和260nm处测得的吸光度值） 还可以通过下述经验公式直接计算出溶液中蛋白质的含量：

蛋白质浓度（mg/mL）=F×A280×D×1/d

其中d为石英比色皿的厚度cm，D为溶液稀释的倍数，F为校正因子。