植物乳杆菌真空冷冻干燥保护剂配方优化

第３４卷第６期　南昌大学学报（理科版）　Ｖｏ１．３４　Ｎｏ．６　２０１０年ｌ２月　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎａｎｃｈａｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）　Ｄｅｃ．２Ｏ１０　文章编号：１００６—０４６４（２０１０）０６—０５６１—０５　植物乳杆菌真空冷冻干燥保护剂配方优化　熊　涛　，黄锦卿　，宋苏华　，王韵　，谢明勇　，　（南昌大学ａ．食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌３３００４７；ｂ．生命科学与食品工程学院，江西南昌３３００３１）　摘要：采用单因素实验和Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ响应面实验设计联用的方法，筛选和优化植物乳杆菌ＮＣＵ１１６真空冷冻　干燥的保护剂配方。单因素实验结果表明：海藻糖、Ｄ一山梨醇和脱脂奶粉３种保护剂效果好，能够显著提高菌种　对冷冻干燥环境的耐受能力。响应面实验以上述３种保护剂为自变量，细胞存活率为响应值，结果表明：以脱脂奶　粉、海藻糖和Ｄ一山梨醇的浓度分别为９．２４％、４．４７％和１３．４２％作为冻干保护剂配方进行验证试验，细胞存活率　达到９１．７６％±１．８２％，与理论预测值相符。　关键词：植物乳杆菌ＮＣＵ１１６；真空冷冻干燥；保护剂；配方；优化　中图分类号：ＴＳ２０１．３　文献标志码：Ａ　直投式发酵剂是一种不需活化和扩增便能直接　食品科学与技术国家重点实验室保藏。　应用于生产的新型发酵剂，具有活菌含量高（１０　～　１．２材料与培养基　１０　／ｇ）、保质期长、批次发酵产品问质量稳定性高　脱脂奶粉（雀巢公司）、海藻糖（Ｈａｙａｓｈｉｂａｒａ　等优点，也防止了菌种退化和污染，大大提高了发酵　Ｃｏ）、蔗糖（上海豪申化学试剂有限公司）、葡萄糖　制品工业的劳动生产率和产品质量　Ｊ。直投式发　（上海豪申化学试剂有限公司）、麦芽糊精（河北华　酵剂已广泛应用于发酵乳制品，特别在发酵蔬菜中　辰淀粉糖有限公司）、Ｄ一山梨醇（国药集团化学试　的应用成为新的发展趋势。　剂有限公司）、甘油（江西大学科技产业联会）、谷氨　在发酵蔬菜用直投式乳酸菌发酵剂生产过程　酸钠（上海太太乐食品有限公司）、ＶＣ（天津市恒兴　中，冷冻干燥保护剂是关键技术之一，直接影响乳酸　化学试剂制造有限公司）、硫酸锰（汕头市西陇化工　菌的存活率、发酵活力以及贮藏稳定性＿２　Ｊ。因此研　厂）等均为分析纯试剂或生化试剂，谷氨酸钠为食　究高效的冻干保护剂极为重要，使其最大限度发挥　品级，含量为９９％；海藻糖和脱脂奶粉为食品级。　保护功能，提高乳酸菌的存活率。　ＭＲＳ培养基　］：蛋白胨ｉ％、牛肉膏ｉ％、葡萄　响应面方法（ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ，　糖３％、乙酸钠０．５％、酵母膏０．５％、柠檬酸二铵　ＲＳＭ）是一种有效的多变量系统寻优的试验策略。　０．２％、磷酸氢二钾０．２％、硫酸镁０．０２％、Ｔｗｅｅｎ８０　而Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ响应面法是一种统计学试验设计　０．１％。（ｐＨ　６．５、１２１　ｏＣ、３０　ｍｉｎ灭菌）　方法，目前常被用于工艺流程的优化。该法不仅可　１．３仪器与设备　以建立连续变量曲面模型，对影响生物过程的因子　ＤＮＰ一９２７２型电热恒温培养箱（上海精宏实验　及其交互作用进行评价，确定最佳水平范围，而且所　设备有限公司）、Ａｎｋｅ　ＬＸＪ～Ｉ１　Ｂ型高效离心机（上　需的试验组数相对较少，可节省人力物力　。　海安亭科学仪器厂）、ＬＧＪ一１Ａ一５０型真空冷冻干　本研究先采用单因素实验确定脱脂乳、海藻糖、　燥机（北京亚泰科隆实验科技开发中心）、超低温冰　Ｄ～山梨醇等３种效果较好的保护剂，再用Ｂｏｘ—　箱（Ｈａｉｅｒ）、ＹＸＱ～ＬＳ５０ＳＩＩ型灭菌锅（上海博讯实业　Ｂｅｈｎｋｅｎ响应面对这３种保护剂的最佳水平及其交　有限公司）、ＢＨＣ一１３００　Ｉ１　Ａ／Ｂ３型超净工作台（苏　互作用做进一步的研究和探讨。　净集团安泰公司）、ＰＢ２０３一Ｎ型电子天平、ＸＳＺ一４Ｇ　１材料与方法　型显微镜（重庆光学仪器厂）。　１．４工艺流程　１．１菌种　菌种活化一富集培养一离心收集菌体（称湿　植物乳杆菌ＮＣＵ１１６（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ），南昌大学　重）一加保护剂一活菌计数一分装一预冻一真空冷　收稿日期：２０１０—０７—１０。　基金项目：国家教育部留学回国人员创业基金项目［２００９年１３５号］。　作者简介：熊涛（１９７０一），男，教授，博士生。　・５６２・　南昌大学学报（理科版）　２０１０年　冻干燥一冻干粉（称重）一活菌计数　１．４．１　菌体的制备　接斜面上的菌种至灭菌的　１００　ｍｌＭＲＳ培养基中，３６．５　ｃ【＝下静置培养１０　ｈ，经　表１　保护剂单因素实验结果　显微镜检确定无杂菌后，按３％的接种量转接到　１　０００　ｍｌＭＲＳ培养基中，３６．５　ｏＣ下富集培养２０　ｈ，　４　５００　ｒ／ｍｉｎ离心１５　ｍｉｎ，收集菌体。　１．４．２保护剂的制备预先把海藻糖、蔗糖、葡萄　糖、麦芽糊精、Ｄ一山梨醇、甘油、谷氨酸钠、ＶＣ、脱脂　奶粉、硫酸锰分别取出一定量溶解于１００　ｍＬ无菌水　中，再置于带塞玻璃瓶内，１２１　ｏＣ、灭菌３０　ｍｉｎ。保　护剂溶液用量为原发酵液１０％。　１．４．３活菌计数　样品稀释一定倍数制成菌悬　结构和功能是必不可少的，当生物大分子失去维持　其结构和功能特性的水膜时，海藻糖所含羟基基团　的氢键结合到膜的磷酸基团和蛋白质极性基团，取　液后，用５　ｌ微量定量移管吸取菌悬液置干净载玻　片上，加５　ｌ的０．１％美蓝染液，盖上盖玻片，注意　不可有气泡，也不可将菌液溢出盖玻片以外，将美蓝　浸片置显微镜目镜１６×，接物镜４０×下镜检，按分　代了结晶水，形成一层保护膜以代替失去的结构水　膜；另一种称为“玻璃态”假说，该假说认为海藻糖　布选择浸片４个角和中央的ｌ０～２０个视野并计算　活菌体数，求出每个视野中的乳酸活菌数平均值Ａ，　视野面积为Ｂ，盖玻片面积为ｃ，稀释倍数为Ｄ，则　每ｍＬ或每ｇ样品中的活菌数为：Ｃ／Ｂ×Ａ×（１０００／　５）×Ｄ。　的重要作用是形成玻璃态结构保护层，而不是结晶，　导致无定形连续相的形成，在这种结构中分子运动　和分子变性反应非常微弱　Ｊ。　脱脂奶粉是一种高分子复合保护剂，不论是单　独使用还是与其他保护剂混合使用，均有较好的保　护效果。因为在冷冻干燥时，乳清蛋白能在菌体外　１．４．４真空冷冻干燥　把加入保护剂的菌悬液倒　入无菌培养皿中，放在一７Ｏ℃下预冻２　ｈ，取出放人　真空冷冻干燥机中，干燥２４　ｈ。　１．５细胞存活率的计算　形成蛋白膜，对细胞加以保护，并可固定冻干酶类，　细胞存活率＝　幸需　嚣　籍　２结果与分析　２．１保护剂单因素实验　×　ｏｏ％　且脱脂奶粉中其它成分也可提高菌体的冷冻干燥存　活率ｕ　，为冻干物提供轻而多孔的结构，增强菌粉　的复水性。　Ｄ一山梨醇具有多个羟基，在冻干过程中可取　代水分子与菌体细胞膜磷脂中的磷酸基团或与菌体　蛋白质极性基团形成氢键，保护细胞膜和蛋白质结　构与功能的完整性，因此具有较好的保护效果　。　２．２保护剂浓度的选择　本实验将１０％脱脂奶粉、１０％蔗糖、１０％葡萄　糖、１０％麦芽糊精、５％Ｄ一山梨醇、５％甘油、５％谷　氨酸钠、５％ＶＣ、０．５％硫酸锰、５％海藻糖等１０种保　护剂分别进行冻干单因素实验，考察对植物乳杆菌　ＮＣＵ１　１６的冻干保护作用，结果如表１所示。　按照冻干前样品的活菌数为１．５×１０“ｍＬ～，　分别考察海藻糖、Ｄ一山梨醇和脱脂奶粉３种保护　剂不同质量浓度对菌体冻干后细胞存活率的影响。　由表ｌ可以看出，１０种保护剂对植物乳杆菌　由图１、图２、图３可知，前期细胞存活率随着保　护质量剂浓度的增加而提高，但到一定浓度后，随着　保护剂质量浓度的增加反而降低。其原因是由于高　浓度的保护剂加速细胞内的蛋白质聚合，形成较强　玻璃化结构，反而不利于细胞的超低温保存，复水效　ＮＣＵ１１６保护作用的影响大小次序为：海藻糖＞脱　脂奶粉＞Ｄ一山梨醇＞硫酸锰＞谷氨酸钠＞葡萄糖　＞ＶＣ＞麦芽糊精＞甘油＞蔗糖。其中海藻糖与脱　脂奶粉的冻干保护效果最为明显。　研究表明，海藻糖对细胞有很好保护作用。目　前主要有２种假说解释海藻糖保护机制：一种称为　“水替代”假说，该假说认为生物体大分子物质周围　果不好。这说明保护剂质量浓度不是越高越好，而　是有一个最佳浓度。脱脂奶粉最佳质量浓度为　１０％，海藻糖最佳质量浓度为５％，Ｄ一山梨醇最佳　质量浓度为１０％。　均包围着一层水膜，这层水膜对维持生物大分子的　第６期　熊涛等：植物乳杆菌真空冷冻干燥保护剂配方优化　Ｙ：ｃ。＋互ｎ　＋　６　￡ｘｊ　瓣　镶　姥　式中：ｙ为预测响应值；　和ｘｉ为自变量编码值；　璺　器　Ｃ。为常数项；　口　为线性系数；　脱脂乳质量浓度／％　６　为二次项系数；　图１　脱脂奶质量粉浓度对细胞存活率的影响　１７，为因子数，本试验中为３。　按照Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ响应面实验设计的统计学　要求，对二次多项方程中各项回归系数需要ｌ７组试　僻　餐　验进行回归拟合，结果见表３。　籍　性　２．３．１模型方程的建立与显著性检验　基　最　表３　Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ响应面实验设计以及菌种细胞存活率　的实测值与预测值　海藻糖质量浓度／％　图２海藻糖质量浓度对细胞存活率的影响　碍　热　璺　最　Ｄ一山梨醇质量浓度／％　图３　Ｄ一山梨醇质量浓度对缎胞存活率的影响　２．３　Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ响应面实验设计及结果　以菌种细胞存活率作为响应值，自变量为保护　剂单因素实验结果中确定的脱脂奶粉、海藻糖和Ｄ　一山梨醇３种保护剂，分别以Ａ、　和Ｃ代表，每个　自变量的低、中、高实验水平编码为一１、０、１（见表　２）。为了减小误差，统一其他影响不显著的因素，　如接种量为３％，ｐＨ值为６．５，发酵液培养时间ｌ６　实验设计及结果见表３，利用Ｄｅｓｉｇｎ　Ｅｘｐｅｒｔ软　ｈ，离心速率为４　５００　ｒ／ｍｉｎ，时间１５　ｍｉｎ。种子液活　件，通过表３中菌种细胞存活率实验数据对二次多　菌数为６．５６８　Ｘ　１０　ｃｆｕ／ｍＬ，每瓶发酵液活菌数为　项方程进行多元回归拟合，获得植物乳杆菌　ＮＣＵ１　１６细胞存活率对编码自变量脱脂奶粉、海藻　６．７５１×１０　ｃｆｕ／ｍＬ。实验中实验因素真实值与编　糖和Ｄ一山梨醇的二次多项回归方程：　码值符合方程：Ａ＝（脱脂奶粉一１０）／５；Ｂ＝（海藻　细胞存活率＝８８．８４一ｇ．９６Ａ一９．７ｇＢ＋２３．９Ｃ　糖一５）／２．５；Ｃ＝（Ｄ一山梨醇一ｌｏ）／５。　一２０．８９Ａ　一２３．１２Ｂ　一１８．１４Ｃ　一６．ｇｌＡＢ一４．０５ＡＣ　表２响应面分析因素和水平表　一１．４ＢＣ　（１）　从该模型的方差分析（表４）可见，实验所选用　的二次多项模型具有高度显著性（Ｐ　。＜０．０００　１），失拟项不显著（Ｐｋ　ｎｔ＝０．０５１　５），其校正决定　系数为ｒ２　＝０．９７６　０，说明有约９７．６％的菌种细胞　存活率变化能由此模型进行解释；相关系数为／２＝　设该模型通过最小二乘法拟合的二次多项方程　０．９８９　５，说明模型对实际情况拟合好。　为：　由表４可见，３个因素对植物乳杆菌ＮＣＵｌｌ６细　・５６４・　南昌大学学报（理科版）　２０１０矩　表４细胞存活率响应面实验方差分析表　胞存活率的线性效应皆显著，特别是因素　和Ｃ对　细胞存活率的线性效应极其显著；因素Ａ　、Ｂ　、Ｃ　对　细胞存活率的曲面效应皆极其显著；ＡＢ交互影响皆　＿【０目０ｄｓ∞　显著，ＡＣ、ＢＣ交互影响不显著。　２．３．２植物乳杆菌ＮＣＵ１１６细胞存活率的响应曲　面分析通过方程（１）可作出对应的响应等高图及　其曲面图（见图４、图５和图６）。等高线图直观地反　映出各因素交互作用对响应值的影响，圆形表示两　因素交互作用不显著，椭圆形表示两因素交互作用　显著　”Ｊ。从图４、图５和图６可以看出ＡＢ交互　影响细胞存活率最显著，在Ｂ为一０．５～０之间时，　细胞存活率将达到理论最大预测值９８．４２％。　２．３．３最佳保护剂组合的确定　通过对菌种细胞　存活率曲面方程（１）求解可知，在脱脂奶粉、海藻糖　和Ｄ一山梨醇的浓度分别为９．２４％、４．４７％和　１３．４２％时，植物乳杆菌ＮＣＵ１１６细胞存活率的最大　预测值为９８．４２％。用此配方保护剂冻干菌种进行　实际试验验证，细胞存活率达到９１．７６％±１．８２％，　与理论预测值较为相符，说明该保护剂配方的优化　００　一１．００—１．００　图４脱脂奶粉和海藻糖交互影响细胞　存活率的曲面图及其等高线图　｛啦　苦　　ＩＵ　兽　＆　器　００　图５脱脂奶粉和Ｄ一山梨醇交互影响细胞　存活率的曲面图及其等高线圈　镳　茸　１　０　０　第６期　熊涛等：植物乳杆菌真空冷冻干燥保护剂配方优化　・５６５・　Ｆｏｏｄ　Ｒｅｓ，１９９２，２５：２５３—２６１．　［２］董英，林泽营，周国磊，等．泡菜乳酸菌冻干保护剂的　研究［Ｊ］．食品工业，２００７，３４（１）：ｌ０—１２．　［３］　ＡＮＮＡＤＵＲＡＩ　Ｇ．Ｄｅｓｉｇｎ　ｏｆ　Ｏｐｔｉｍｕｍ　Ｒｅｓｐｏｎｓｅ　Ｓｕｒｆａｃｅ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｆｏｒ　Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｄｉｒｅｃｔ　Ｄｙｅ　ｏｎ　Ｃｈｉｔｏｓａｎ　［Ｊ］．Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０００，２３：４５１—４５５．　［４］ＥＳＴＥＲ　Ｒ　Ｇ，ＡＬＶＡＲＯ　Ｂ　Ｎ，ＡＬＢＥＲＴＯ　Ｃ　Ｂ　Ｊ．Ｏｐｔｉｍｉｓａ—　ｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｃｌａｖｕｌａｎｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｐｒｏｄｕｃ—　００　ｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　Ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｎｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔ—　ｔｅｒｓ，２００１，２３：１５７—１６１．　［５］　ＡＭＢＡＴＩ　Ｐ，ＡＹＹＡＮＮＡ　Ｃ．Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｃｏｎｓｔｉｔｕ—　ｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　Ｃｉｔｒｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｐｒｏｄｕｃ—　图６海藻糖和Ｄ一山梨醇交互影响细胞　ｔｉｏｎ　Ｆｒｏｍ　Ｐａｌｍｙｒａ　Ｊａｇｇｅｒｙ　Ｕｓｉｎｇ　Ｒｅｓｐｏｎｓｅ　Ｓｕｒｆａｃｅ　Ｍｅｔｈ一　存活率的曲面图及其等高线图　０ｄ［Ｊ］．Ｗｏｒｌｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌｏｇｙ，　可信程度较高。　２００１，１７：３３１—３３５．　［６］　熊泽，仇敏，邵伟，等．瑞士乳杆菌冻＝Ｆ发酵剂制备中　３　结论　保护剂的选择［Ｊ］．冷饮与速冻食品工业，２００６，１２　采用单因素实验和Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ响应面实验　（３）：２０～２４．　设计，利用Ｄｅｓｉｇｎ　Ｅｘｐｅ￣软件，筛选和优化出植物乳　［７］　熊涛，王韵，曾哲灵，等．一种改良的乳酸菌活菌数快速测　定方法［Ｊ］．食品与发酵Ｊ＝业，２００９　３５（１０）：１３２—１３４．　杆菌ＮＣＵ１１６真空冷冻干燥的保护剂最佳配方为　［８］戴秀玉，王忆琴，周坚，等．大肠杆菌海藻糖的代谢调　９．２４％脱脂奶粉、４．４７％海藻糖和１３．４２％Ｄ一山梨　控［Ｊ］．中国生物工程杂志，２０００，２０（６）：２６—２９．　醇，脱脂奶粉、海藻糖和Ｄ一山梨醇同是影响植物乳　［９］蒲丽丽，刘宁，霍贵成．嗜热链球菌冻干保护剂保护作　杆菌ＮＣＵ１１６细胞存活率的关键因素。在优化配方　用的研究［Ｊ］．食品科技，２００７（７）：３２—３４．　条件下真空冷冻干燥验证试验，植物乳杆菌　［１Ｏ］徐致远，刘荣，郭本恒，等．保护剂在乳酸菌冻干过程　ＮＣＵ１１６细胞存活率达到９１．７６％±１．８２％，与理论　中的应用［Ｊ］．乳业科学与技术，２００６（４）：１５５—１５７．　［１１］山丽杰，田洪涛．浓缩型乳酸菌发酵剂制备中几个技　最大预测值９８．４２％较相符，研究结果对微生物细　术关键问题的探讨，中国乳品工业，２００２，３０（５）：６．　胞冻干实践具有一定的指导意义。　［１２］应芝，励建荣，韩晓祥．响应面分析优化桑叶多糖提取　工艺的研究［Ｊ］．中国食品学报，２００８（４）：３９—４５．　参考文献：　ｆｌ３］刘成梅，张彦军，李傲，等．响应面分析法优化稻壳灰　［１］　ＡＵＫＲＵＳＴ　Ｔ，ＢＩＯＭ　Ｈ．Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕａ　制备纳米级白炭黑工艺［Ｊ］．南昌大学学报：理科版，　ＳｌｌＲｉｎｓ　Ｕｓｅｄ　ｉｎ　Ｍｅａｔ　ａｎｄ　Ｖｅｇｅｔａｂｌｃ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．　２００９（５）：４３８—４４３．　Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ａｇｅｎｔ　Ｆｏｒｍｕｌａ　ｆｏｒ　Ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｙｉｎｇ　ｏｆ　ＬａｃｔＯｂａｃｉＵｕｓ　Ｐｌａｎｔａｒｕｍ　ＸＩＯＮＧ　Ｔａｏ　，ＨＵＡＮＧ　Ｊｉｎ．ｑｉｎｇ　，ＳＯＮＧ　Ｓｕ。ｈｕａ　，ＷＡＮＧ　Ｙｕｎａ＇ｂ，ＸＩＥ　Ｍｉｎ．ｙｏｎｇ　（ａ．Ｓｔａｔｅ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｎａｎｃｈａｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｃｈａｎｇ　３３００４７，Ｃｈｉｎａ；　ｂ．Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｌｃｉｅｎｃｅｓ　ａｎｄ　Ｆｏｏｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｎａｎｅｈａｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｃｈａｎｇ　３３００３　１，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ａｇｅｎｔ　ｆｏｒｍｕｌａ　ｏｆ　ｒｆｅｅｚｅ—ｄｒｙｉｎｇ　ｆｏｒ　Ｌａｅｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｌａｎｔａｒｕｍ　ＮＣＵ１　１６　ｗａｓ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｂｙ　ｓｉｎｇｌｅ　ｆａｃｔｏｒ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ａｎｄ　ａ　ｔｈｒｅｅ—ｆａｃｔｏｒ　Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ　ｄｅｓｉｇｎ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｓｉｎｇｌｅ　ｆａｃｔｏｒ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｒｅ—　ｈａｌｏｓｅ．Ｄ—ｓｏｒｂｉｔｏｌ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｓｋｉｍ　ｍｉｌｋ　ｈａｄ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ　ｅｆｆｅｃｔ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｏｆ　ｆｒｅｅｚｅ．ｄｒｙｉｎｇ　ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ　ｃｒｉｔｉｃａｌ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｆｏｒ　ｔｈｉｓ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ　ｔｈｅ　ｓｋｉｍ　ｍｉｌｋ，ｔｒｅｈａｌｏｓｅ，ａｎｄ　Ｄ—ｓｏｒｂｉｔｏｌ，ｔｈｅ　ｃｅｌｌ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｒａｔｅ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｖａｌｕｅ．Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｆｏｒｍｕｌａ　ｗａｓ　ｓｋｉｍ　ｍｉｌｋ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　９．２４％．ｔｒｅｈａｌｏｓｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　４．４７％ａｎｄ　Ｄ—ｓｏｒｂｉｔｏｌ　ｃｏｎ．　ｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　１３．４２％．Ｔｈｅ　ｅｆｉｆｃｉｅｎｃｙ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ａｇｅｎｔ　ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ　ｏｐｔｉｍｚｅｄ　ｈａｓ　ｂｅｅｎ　ｔｅｓｔｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌｓ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｒａｔｅ　ｒｅａｃｈｅｄ　９１．７６％±１．８２％ｉｎ　ｆｒｅｅｚｅ—ｄｒｙｉｎｇ　ｐｒｏｃｅｓｓ，ｉｔ　ｍｏｒｅ　ｉｎ　ｌｉｎｅ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　ｐｒｅ—　ｄｉｃｔｉｏｎ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｌａｎｔａｒｕｍ　ＮＣＵ１１６；ｖａｃｕｍｎ　ｆｒｅｅｚｅ　ｄｒｙｉｎｇ；ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ａｇｅｎｔ；ｆｏｒｍｕｌａ；ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ