窖泥检测原理和方法分析

窖泥取样

窖泥是浓香型大曲酒生产过程中的重要条件之一，它对酒中微量香味成分的形成及其量比关系起着重要的作用。窖泥质量的好坏直接影响浓香型大曲酒产品的质量。

取回的泥样（包括人工培窖的黄泥、发酵泥、复壮泥）因水分大，不宜长期贮存，应立即平摊在瓷盘、木板，或光洁地面上，层厚约2cm，风干3~5昼夜，间隔翻拌，使之均匀风干。在半干时，将大块土捣碎，以免完全干后成硬块，不易粉碎。

泥样风干后，用四分法分取约250g，研磨成粉，并通过60目筛，保存在磨口瓶中。 氨态氮在风干过程中易变化，需用新鲜的泥样测定，同时测定水分，以换算为绝干样的含量。

一、水分含量的测定（常压干燥法）

1．原理

窖泥中水分一般可分为三类，即化合结合水，吸湿水，和自由水。本法在105-110℃烘干法，在此温度下自由水和吸湿水都能烘干，实际上在此温度下所失去的是挥发性物质的总量。

2．仪器

电热鼓风干燥箱（烘箱）；称量皿（可用滤纸包代替）；电子天平。

3．方法

（1）风干土样水分测定：取风干土样4－5g，平铺于已烘干至恒重的称量皿中。在105－110℃烘箱内烘6h后，取出、加盖，在干燥器中冷却30min后称重，再于100－105℃烘1h，冷却、称重，直至恒重（两次质量差小于0.002g）。

（2）新鲜土样水分测定 称取土样10－15g。测定方法同（1）。

4．计算

水分(%)mm1100%

mm0w一水分和挥发物含量，％； m——烘干前空皿与试样质量之和, g. ml——烘干后空皿与试样质量之和, g.

二、pH的测定

1．原理

因酿酒微生物生长繁殖过程中的生化变化和代谢产物受害泥pH的影响较大，故在人工培容过程中，必须测定土壤的pH。

窖泥经水提取后，用pH计测定。

2．仪器和试剂

（1）酸度计：测定范围pH 0—14，最小分度为0.02pH （2）pH标准缓冲溶液。

3．测定步骤

按仪器说明书校正PH计，并注意校正和测量时温度一致。

将电极和小烧杯用蒸馏水冲洗干净，再塌样品冲洗6－8次，将电极插入盛有样品的小烧杯中，测量样品的PH。

称取风干、粉碎后的土样5.0g，于100mL烧杯中加水50mL，间歇搅拌30min，放置30min，用pH计测定试样pH。

三、氨态氮的测定

1．原理

奈氏试剂与氨反映生成浅黄色至红棕色的络合物。氨态氮浓度低时，溶液成黄色，可在400-425nm测定吸光度。氨态氮浓度高时，溶液成红色，可在450-500nm测定吸光度。测得的吸光度与标准比较即可求得氨态氮的浓度。当氨态氮高于1mg/L时，产生红褐色沉淀，则不能比色。本法测得的氨态氮是游离氨和铵离子含氮的总量，因为铵盐在碱性溶液中将转变为能与奈氏试剂反应的氨。溶液中氨越多，则生成黄色越深。溶液中某些杂质（Ca、Mg等离子）的存在，能与奈氏试剂形成沉淀，使溶液浑浊干扰氨的测定。为避免此有害作用，故在待测液中加入酒石酸钾钠，可与Ca、Mg作用生成不解离的化合物，就可避免与奈氏试剂的相互作用。

2．试剂

（1）奈氏试剂：称取10g碘化汞、7g碘化钾，溶解后加到50mL360g／LNaoH溶液中，摇匀，稀释至100mL，摇匀，静置，取上层清液使用。贮存于棕色具胶塞瓶中，可保存1年。

（2）酒石酸钠钾溶液：50g酒石酸钠钾溶于100mL水中，为驱除酒石酸钠钾中可能存在的铵盐，煮沸蒸发约1／3体积，冷却后再稀释至100mL。

（3）氯化铵标准液：准确称取0.3819gNH4Cl，溶于水并定容至100mL。其浓度以N

计为1mg/mL

（4）氯化铵标准使用液：吸取氯化铵标准液10mL用水稀释定容至1L。 浓度以N计为10ug／mL，以NH3计为12.2ug／mL。

其余： 100g/L的氯化钠溶液 ； 比色管； 纳氏试剂；分光光度计。

3．测定步骤

（1）试样制备 称取新鲜泥样1—5g(准确至0.01g)，加入100g／L的 氯化钠溶液，使体积为25mL，搅匀，浸出10min(必要时把硬块捣碎)，用于滤纸过滤后备用。吸取1mL滤液(必要时用水稀释后再吸取)于50mL比色管中，用水稀释至刻度。加人1—2滴酒石酸钠钾溶液和1mL纳氏试剂，充分混匀。放置10min后以标准系列中“0”管为空白，于波长425nm处测吸光度。

（2）标准系列配制 吸取标准使用液(10ug／mL的氮) 0mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL、10.0mL分别置入50mL比色管中，用水稀释至刻度后，按试样相同显色、测吸光度。以吸光度对氨态氮（N）微克数绘制标准曲线。或用目测法进行比较。

4．计算

氨态氮(绝干计，mg／100g)＝c*25*n*(1/m)*(1/1000)*100*[1/(1-w)] 式中

c―― 试样溶液中氨态氮质量，ug； 25——泥样稀释体积，mL；

n——试样再稀释倍数，若不再稀释，则n=1； m——新鲜泥样质量，g

1000——把ug换算成mg的系数， w——新鲜泥样水分，％。

四、有效磷测定

1．原理

测定窖泥中有效磷时，采用酸性氟化铵浸提，提出的磷酸或磷酸盐，在酸性溶液中加入酸性钼酸铵，生成黄色磷钼酸盐，再和还原剂氯化亚锡作用生成蓝色的络合物，比色测定。

2．试剂

（1）氟化铵—盐酸溶液：称取0.56g氟化铵溶于400mL水中，加人12.5mL 1mol/L HCl

溶液，用水稀释至500mL，贮于塑料瓶中。

（2）酸性钼酸铵溶液：称取5g钼酸铵溶于42mL水中；在另一烧杯中注人8mL水和82mL浓盐酸。然后在搅拌下把钥酸铵溶液倒入烧杯中，贮于棕色瓶中。

（3）氯化亚锡溶液：称取1g氯化亚锡(SnCl2·2H20)溶于40mL 1mol／L HCl溶液中，

贮于棕色瓶中。

（4）无磷滤纸：将直径为9cm的定性滤纸浸于0．2mol/LHcl溶液中4—5h，使磷、砷等化合物溶出，取出后用水冲洗数次，再用0.2mol/L HCl淋洗数次。最后用水洗至无酸件，在60℃烘箱中干燥。

（5）磷标谁液：准确称取于110℃干燥2h后冷却的磷酸二氢钾(KH2PO4) 0.2195g，溶于水，并定容至1L。此溶液含磷为50ug/mL。

（6）磷标准使用液：准确吸取磷标准溶液25mL于250mL容量瓶中，用水稀释至刻度，其浓度为5ug/mL。

3．测定步骤

（1）试样处理 称取2.00g风干土样于50mL烧杯中，加入氯化铵-盐酸溶液至20mL浸泡30min，每隔5min搅拌1次。然后用烘干的无磷滤纸过滤，加入约0.1g硼酸，摇匀，使之溶解后备用。

（2）磷的测定 吸取1mL试样浸出液，注入25mL容量瓶中，用水稀释至刻度。吸取此稀释液1—2．5mL(视磷含量多少而异，一般黄泥含磷少，可直接取浸出滤液测定。窖皮泥磷含量较高，吸取稀释液2．5mL测定。老窖泥含磷量多，吸取1mL稀释液即可)，于25mL比色管中，加入2mL酸性铜酸铰溶液和3滴氯化亚锡溶液，用水稀释至刻度。放置15min后，用2cm比色皿在680nm波长处，以标准系列中“0”管为空白测定吸光度。

（3）标准系列制备 吸取磷标准使用液0mL 0.5mL、1.0mL 2.0mL、3.0mL、5.0mL，分别注入25mL比色管中。加入2mL酸性相酸铰溶液和3滴氯化亚锡溶液显色，用水稀释至刻度。同上条件测定吸光度，以吸光度为纵坐标，标准液的磷微克数为横坐标，绘制标难曲线。

4．计算

有效磷含量(mg／100mg)＝m1*(1/v)*25*20*(1/m)*(1/1000)*100*[1/(1-w)] 式中

m1一—试样溶液中有效磷质量，ug v——吸取稀释试样的体积，mL 25——稀释试样总体积，mL 20——试样浸取液体积，mL m一风干泥试样质量，g w一风干试样水分，％。

五、有效钾

1．原理

测定有效钾时用碳酸铵将试样中的钙镁沉淀，然后用灼烧法除去铵盐。再在微酸性溶液

中用亚硝酸钴钠沉淀钾。生成的亚硝酸钴钾钠的黄色沉淀在酸性溶液中，用过量的高锰酸钾分解，剩余的高锰酸钾加过量草酸钠除去。多余的草酸钠在用高锰酸钾回滴。由高锰酸钾与亚硝酸钴钾钠反应的实际消耗量计算试样中的钾含量。

2．试剂

①碳酸铵溶液：称取28.5g碳酸铵溶于水，稀释至1L。

②0.01mol／L硝酸溶液：取6.7mL浓硝酸用水稀释至1L。再稀释10倍为0.01mol/L。 ③200g／L亚硝酸钴钠溶液：称取10g亚硝酸钴钠，溶于50mL水中，临用时配制。 ④0.01mol／L硼酸溶液：称取0.6g硼酸溶于水，稀释至1L。

3．测定步骤

①试样处理：准确称取2．500g风干土样于250mL具塞三角瓶中，加入100mL碳酸铵溶液，浸出1h，其间每15min摇动1次。然后用1号烧结玻璃滤器上铺滤纸片抽气过滤，用100mL钼酸铵溶液分3—4次洗涤。过滤速度不宜太快，以使土壤胶体吸附的钾全部置换出来，将浸出液定量移人蒸发皿内，在水浴上蒸于。残渣加3—5mL硝酸再蒸干，并反复操作3次，至有机物去净。蒸干后，在低于500℃的条件下灼烧去除氨，冷却至室温。 ②钾的沉淀：在灼烧去除氨的试样蒸发皿中，准确加入25mL 0.1mol/L硝酸溶液，用带橡皮头的玻璃棒洗皿壁，使残留物溶解并混合均匀。迅速用干滤纸过滤于50mL三角瓶中，吸取10mL滤液于200mL烧杯中，边搅拌边徐徐加入10mL亚硝酸钻钠溶液，盖好表面皿，在20℃放置过夜，使沉淀完全。

用2号烧结玻璃滤器上铺定量滤纸片(事先烘干至恒重)，抽气过滤，将0.01mol／L硼酸将杯中沉淀全部移人滤器。再用0.01mol/L硝酸洗沉淀10次．每次1mL。接着用95％的乙醇洗5次，每次2mL。擦干滤器外避，在110℃烘1h，置干燥器中冷却后称重。

4．计算

沉淀组成为K2NaCo(Na3)6·H2O，其中K2O＝17.216％ X=m1*0.17216*(1/10)*25*(1/m)*1000*100*[1/(1-w)] 式中

x —绝干试样中有效钾含量(以K20 计），mg/100g; ml一亚硝酸钴钠钾沉淀质量，g; m一风干试样质量，g; 10一一测定时吸取浸出液体积 25一—浸出液总体积，mL； 1000－一换算成mg的系数； w——试样水分，％。

六、钙的测定

1．原理

样品经灰化后，在酸性溶液中，钙与草酸生成草酸钙，经硫酸溶解后，用高锰酸钾标准溶液滴定，从而计算出钙的含量。反应如下：

CaCl2(NH4)2C2O4CaC2O42NH4Cl CaC2O4H2SO4CaSO4H2C2O4

KMnO45H2O3H2SO4K2SO42MnSO410CO28H2O

2．试剂

（1）1：1盐酸溶液； （2）0.1%甲基红指示剂； （3）1：4乙酸溶液； （4）1：4氢氧化铵溶液； （5）2N硫酸溶液； （6）4%草酸铵溶液； （7）1N高锰酸钾标准溶液。

3．测定方法

（1）样品处理：准确称取均匀样品2.00~4.00g，置于坩埚中，在电炉上小火炭化无烟，移入550~600C高温炉中灰化，直至灰分呈白色为止（必要时，可在加入浓硝酸润湿后再灰化，有促进样品灰化至白色的作用）。取出出，待冷却后加入6N盐酸溶液20ml，加热溶解灰分，然后用水称入100ml容量瓶中，辊入至刻度，摇匀。

（2）样品分析：准确吸取样品溶液5ml，移入15ml离心管中，加入甲基红指示剂1滴、4%草酸铵溶液2ml、1：4乙酸溶液0.5ml，振荡均匀。用1：4氢氧化铵溶液将溶液调至微黄色，再用1：4乙酸溶液调至微红色，放置1小时，使沉淀完全析出。离心15分钟，小心倾去上层清液，在沉淀中加入2ml 2N硫酸摇匀，置于70~80C热水浴中，用1 N高锰酸钾标准溶液进行滴定至淡红色不褪色为止。

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4．计算

钙(mg%)=NV20100

5W100 式中 N——高锰酸钾标准溶液的当量浓度； V——滴定所消耗高锰酸钾标准溶液的量； 20——1N高锰酸钾标准溶液1ml相当于钙的量； 说明

用高锰酸钾滴定时要不断振荡使溶液均匀。这方法比较精确，但需要离心沉淀。

七、腐殖质的测定

1．原理

在硫酸存在下，用已知过量的重铬酸钾溶液与窖泥共热，使其中的活性有机质的碳被氧化。而剩余的重铬酸钾，以邻菲罗林亚铁为指示剂，用硫酸亚铁铵溶液滴定，从所消耗的重铬酸钾量来计算有机碳的含量。

2．仪器与试剂

（1）油浴：加热用油为固体石蜡或植物油。 （2）插试管用的铁丝笼。

（3）0.2mol/L硫酸亚铁铵标准溶液（即莫氏盐溶液）：称取80g(NH 4)2So4•FeSO4•6H 20，溶于水中，加入30mL 6mol/L的硫酸，用水稀释至1000mL。

标定：吸取硫酸亚铁铵溶液10 mL，于250mL三角瓶中，加50mL水和10mL6mol/L硫酸。用0.1mol／L高锰酸钾（1/5 KMn04 ）标准溶液滴定至粉红色。

cc1V1 10c —— 硫酸亚铁铵标堆溶液浓度，mol/L； c1 —— 高锰酸钾(1/5 KMno4)标准溶液浓度,mol/L; v1 —— 消耗高锰酸钾标准溶液体积，mL。

（4）重铬酸钾-硫酸溶液：取200g研细的重铬酸钾，溶于250mL水中，必要时加热使完全溶解。冷后稀释至500mL，全部移人1L烧杯中。缓缓加入浓硫酸500ML，冷后加水稀释至1000mL。

（5）5g/L邻菲咯啉指示剂：称取0.5g硫酸亚铁(FeSO4•7H2O)溶于100mL水中，加2滴浓硫酸和0.5g邻菲咯啉，摇匀，该溶液现配现用。

3．测定步骤

称取风干土样0.1－0.3g（准确至0.001g），放入18mm×160mm硬质试管中，准确加入重铬酸钾—硫酸溶液10mL，将试管插人预先加热至185－190℃的油浴中(用铁丝笼固定试管)。此时温度下降到170－180℃，调节热源，保持此温度。当试管内容物被面开始滚动或有较大气泡发生时，开始计时，沸腾5min。取出冷却后把试管内容物全部转移人250mL三角瓶，用水洗净试管，洗液并入三角瓶内，总体积为50一60mL。摘入2—3滴邻菲咯啉指示剂，用0.2mol/L硫酸亚铁铵标准溶液滴定，颜色由橙红变绿，最后呈从紫色为终点。同时做空白试验。

4．计算

x(V0V)c0.0031.7241.1x －－ 干土中腐殖质含量，％；

11100% m1wV0 —－ 空白试验消耗硫酸亚铁铵标准溶液体积,mL; v —－ 测定试样消耗硫酸亚铁铵标准溶液体积,mL;

c —－ 硫酸亚铁铵标准溶液浓度，mol/L;

0.003 －一 消耗1mL1mol/L硫酸亚铁铁标;准溶液相当于碳的克数； 1.1 —－ 氧化校正系数；

1.724 —－土壤中有机质含;碳58％，将有机碳换算成有机质的系数 (100/58＝1．724); m一－风干土试样质量; w一－风干土水分，％。

八、细菌总数测定

仪器 显微镜血球计数板。震荡器。其它稀释取量仪器和盛装仪器 [方法和步骤]

1．总菌计数法

(1)计数样品：称窖泥1g于盛有99mL无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的三角瓶中。 (2)摇匀；振荡10～20min，使土样中的菌体、芽孢或孢子均匀分散。

(3)稀释：将待测茵液作一定比例的稀释。（通常为1：100或1：1000严格按无菌操作） (4)检查计数板：在正式计数前先用显微镜检查计数板的计数室，看其是否沾有杂质或干涸着的曲体，若有污物则需作以下几步清洗：

1)擦洗：用药棉蘸取95%酒精轻轻擦洗计数扳的计数室。

2)冲洗：用蒸馏水冲洗计数板，并用毛边纸吸干其上的水分(注意：切勿用火焰来烤干)；最后用擦镜纸揩干净。

3)镜检：镜检清洗后的计数板，直至计数室无污物时才可用于样品的计数。

(5)加样：先将盖玻片安放在计数室上面，然后用接种环取一环均匀的菌体悬液，使它沿着盖玻片和计数板间的缝隙渗入计数室。连续二至三次，直至充满计数室平台为止： (6)计数：持加好样品的计数板只于显微镜，然后按下列步骤寻找计数室并计数之 1)找计数室：先在低倍镜下寻找计数极上的大方格然后顺大方格移动计数板，使计数室位于视野中间。

2)转换高倍镜：转高倍镜后，适当调令光壳度，使菌休和计数室线条均清晰为止，然后将计数室一角的中格移至视野中。

3)计数通常以计五个中格(做5个板求平均减少误差）的数值来代表计数室中的含菌量。

将凡要计数的中格中的菌休逐一计数。计数时为了避重复或遗漏常将分布在方格线上的菌体一律以接触方格底线和右侧线上的茵作为计入本格内的茵数。同时对于出芽的菌体常以芽体和母体同等大小时才按两个茵体计数，以减少人为计数误差。将计得的菌体数一一记录。 (7)清洗：计数完毕后，计数板先用95％酒精轻轻擦洗，再用蒸馏水淋洗，然后吸干。 [计算]

按所用计数板规格16*25型或25*16型有所不同。

菌数/mL=X*16（或25）*10000*稀释倍数(X为5个中室的平均数） 再按制得的样品总量而求得总菌数 总数=菌数/mL*样品量（mL)

九、芽孢杆菌数测定

1．原理

根据芽孢可在广泛的温度（即热抗性）、pH、渗透压下生长特点，对窖泥中芽孢进行分离和检测的。首先通过升温（80－100℃）热处理（10～30min）来除去非检测菌。这种处理几乎破坏了所有的细菌和营养体而芽孢得以存活，而芽孢可以在适宜的培养基中萌芽并生长。

2．仪器与试剂

（1）

传统的微生物检测方法需在培养基中把单个菌培养成可见菌落，然后经长时间培养和鉴定。

目前乳品厂对芽孢杆菌的检测是根据芽孢可在广泛的温度(即热抗性)、pH、渗透压下生长特点，对乳和乳制品中芽孢进行分离和检测的。首先通过升温(80-100~C)热处理(10～30Inin)来除去非检测菌。这种处理几乎破坏了所有的细菌和营养体而芽孢得以存活。通过这种方式激活的芽孢再在适宜的培养基中萌芽并生长。传统上这种培养基加淀粉以吸收抑制物(乳中大多芽孢杆菌(86％)能水解淀粉，从而促进激活的芽孢萌芽。培养基再在30℃培养3d或37℃2d计嗜温菌数，55℃ 2-3d计嗜热菌数。

这种传统方法操做繁琐， 时间长72h，并需对操作人员进行严格的训练。检测结果存在滞后性， 已难适应工 化生产。