细胞因子融合蛋白技术及其应用前景

细胞因子融合蛋白技术及其应用前景

房永祥, 冯海燕, 莫斯科, 景志忠

【关键词】 细胞因子 融合蛋白

细胞因子是由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成、 分泌的一大类多功能、 高活性的生物物质。它在介导机体多种免疫反映及对各类免疫活性细胞的分化、 发育和活化中起着十分重要的作用。细胞因子融合蛋白(cytokine fusion protein)技术是现今免疫学研究的一个热点方向。该方式是基于这些细胞因子具有相同或相关的功能活性而各自作用靶点不同, 利用基因工程技术将两种或多种细胞因子融合在一路, 其融合基因表达产物既具有其组成因子独特的生物学活性或使其某些活性显著提高, 还可能会通过生物学活性的互补及协同效应发挥出较单一细胞因子简单配伍所不具有的复合生物学功能, 乃至还可能会产生一些新的结构及生物学功能, 这种新型的人工蛋白具有极高的应用价值和良好的进展前景。早在1986年Seno等用含EcoR I的12个核苷酸(4肽)CCGGAATTCATG为接头, 将IFN和IL

2片段加以连接, 结果发觉产生的融合蛋白具有IFN

γ与IL

γ

2的双重活性。迄

今为止, 国内外已接踵报导了多种有价值的细胞因子融合蛋白。现就细胞因子融合蛋白技术的原那么、 构建类型、 应用现状和进展前景做一简要概述。

1 细胞因子蛋白融合技术

蛋白融合的构建原那么 基因工程构建细胞因子融合蛋白须知足以下几个条件: (1)各融合分子的目的DNA片段置于同一套调控序列(包括启动子、 增强子、 核糖体结合序列、 终止子等)的操纵之下。(2)融合分子间须以富含疏水性氨基酸的接头Linker连接, 同时也要考虑接头序列的长度和核苷酸、 氨基酸的组成、 排列顺序等因素。如融合蛋白内部接头的不

同, 可致使融合蛋白各部份化学结构的改变, 而阻碍到各融合分子的空间构象, 致使其生物学活性不同。因此, 设计肽链之间的接头时, 要尽可能不阻碍两头蛋白的自然折叠, 使各融合成份互不干扰。(3)为了保证融合蛋白的生物学活性, 还需考虑组成融合蛋白各成份本身的特性及其彼此作用机制。如肿瘤坏死因子(TNF)和α干扰素(IFN强抗病毒活性等方面有协同作用。有学者构建了TNF和IFN蛋白的抗病毒和抗肿瘤活性与单独应用TNF和IFN

α)在抑制肿瘤细胞、 增

α的融合蛋白, 但发觉该融合

α相较, 抗病毒活性降低24倍, 抗肿

瘤活性降低15倍, 与构建融合蛋白的初衷相背。分析缘故, 可能是这两种细胞因子的理化性质不同较大, IFN彼此的活性。

α活性稳固, 而TNF活性极易丧失, 其融合蛋白在必然程度上阻碍了

蛋白融合Linker的设计与选择 接头序列(Linker)设计是基因融合技术可否成功的关键技术之一。即通过一段适当的核苷酸序列将不同的目的基因连接起来, 使其在适当的生物体内表达到为一条单一的肽链, 其中起连接作用的氨基酸称为Linker[1]。融合蛋白中的两种成份可否别离形成正确的空间结构、 更好的发挥生物学活性, 与连接融合蛋白中两种成份的接头序列紧密相关。重组生成的融合蛋白要求插入融合蛋白中的linker不能阻碍目的蛋白各自的功能。因此, Linker序列的设计和选择对融合基因的构建相当重要。

针对Linker序列的设计和选择己有诸多相关的研究[2]。目前的研究要紧有两种, 即螺旋形式的Linker肽如[A(EAAAK)nA]和低疏水性、 低电荷效应的氨基酸组成的接头, 以后者应用较普遍。这种低疏水性、 低电荷效应的氨基酸组成的多肽接头能够充分伸展以分开两种融合的组分, 使之能在互不干扰的情形下充分折叠成各自的天然构象。Ryoichi等[3]在两种不同功能的融合蛋白之间插入了不同类型的linker序列, 包括可形成螺旋状的不同长度的肽链、 柔性linker和葡萄糖球菌蛋白A(PA)。结果发觉螺旋状的linker同柔性linker及PA一样, 能够有效的将融合蛋白的两个结构域分开, 乃至可增强融合蛋白的功能。Linker的长度是融合基因构建的又一个重要的因素。若是Linker 的长度太长, 那么使融合蛋白对

蛋白酶比较灵敏, 致使活性融合蛋白在生产进程中的产量下降; 应用较短的Linker, 能够克服重组蛋白酶分解的问题, 但可使两个融合分子相距太近致使蛋白功能的丧失。Linker的长度不该小于 nm , 这是由于相邻肽键的距离为 nm, 因此连接肽至少应包括10个氨基酸。目前最为经常使用的是Huston设计合成的(GGGGS)3序列。研究发觉, 连接肽为(Gly4Ser)3的融合蛋白表现出较高的复性效率。这可能是(Gly4Ser)3连接肽较长且柔软, 在复性时能够降低融合蛋白的两组份间的空间位阻, 从而更有利于融合蛋白各个结构域的正确折叠。因此, Linker 的长度不能太长也不能太短。

Linker的选择, 还应考虑Linker内部的氨基酸序列, 研究发觉, Linker组成相同但序列不同时, 构建的融合蛋白的稳固性存在显著不同; 编码Linker的核苷酸组成, 调整编码Linker的核苷酸组成, 虽不改变原接头Linker 的氨基酸序列, 但融合蛋白的表达存在显著不同。Linker序列中有太多的α螺旋和β角结构会限制融合蛋白的伸缩性, 进而阻碍融合蛋白的生物学活性。总之, Linker的选择不是一成不变的, 而要依照融合蛋白分子的大小和特性来决定。

2 细胞因子融合方式及其应用

依照细胞因子融合分子的不同, 可把细胞因子融合蛋白大致分成以下几类:

不同或相同细胞因子的融合蛋白 细胞因子具有多功能性和通用性, 其作用的靶点各有不同。利用细胞因子的这一特点, 能够通过基因融合技术创制出更佳的细胞因子融合蛋白, 其融合基因表达产物极可能表现出双因子简单配伍所没有的复合功能, 而且有可能会增强各个组份间的协同作用。

IL3和GMCSF均为造血刺激因子, 它们对不同发育时期的造血干细胞及祖细胞

均具有促增殖和分化的作用, 且共用受体β链。鉴于二者功能互补, Curtis等于1991年构建并报导了第一个由不同细胞因子组成的融合蛋白人GMCSF融合蛋白, 别离称为PlXYCSF与 IL

321和PIXY

CSF/IL

3和IL

3/GM

344。为确保其各自的天然构象, 在GM

3二者之间均引入了一段疏水氨基酸序列, 从而保证其与受体的结合。体外

321与只表达IL

3受体的JM

1细胞株或只表达GM

3、 GM

受体结合实验证明, PIXYCSF的HL

60细胞株结合时其亲和力比单体略高, 说明该融合蛋白可经IL

CSF结构域与其各自的受体结合。同时, PIXY321对AML骨髓集落的形成都明显高于单独利用IL其作用可提高5～10倍。

3、 GM

193细胞株的增殖作用及刺激

3加GM

CSF的作用,

CSF或IL

IL二、 IL

2/IL

6是两个具有多种免疫调剂活性的细胞因子。1992年Fernad等构建6融合基因, 目的在于构建表达一种具有双重功能的免疫调剂因子, 实

2的活性一致, 较IL

2与IL

6活性中度下降。显现此结果的缘故

了两个人IL

验说明融合蛋白与野生型IL

可能是由于局部构象的改变或是IL6之间的彼此作用干扰所致。体外进一步研

2R和IL

6R, 而且还可作为分子桥梁

究说明, 该融合蛋白既可诱导T、 B细胞表达IL

增进和稳固T、 B细胞间的彼此作用。国内的赵春华等也构建和高效表达了具有增进细胞集落形成、 增进LAK的增殖作用的IL

2/IL

6融合蛋白。将两种相同的细胞因子融合

六、 双体IL

3融合3对人骨

在一路也能够起到明显的生物学功能。马大龙等构建了人双体IL蛋白, 研究说明双体IL

6与单体IL

6在生物学活性上不同不大, 但双体IL3的作用。

髓细胞的集落刺激作用明显高于单体IL

IL7是T、 B淋巴细胞成熟分化进程中重要的细胞因子, 能够增强成熟T细胞的增

殖及其功能, 并有增进CTL增殖、 分化并增强其杀伤活性, 刺激LAK细胞活性的能力。Lai等[4]用一段柔性接头将IL

7和人肝细胞生长因子β片段( hepatocyte growth factor

beta2 chain, HGF beta)连接, 结果发觉融合蛋白能选择性的高效刺激B祖细胞系的增殖。

胰岛素样生长因子(IGF)常与其他生长因子一路发挥协同作用, 是最好的二联细胞因子融合蛋白的备选因子。IGF II可刺激多种组织中细胞的增殖或分化。将IGF II与一段信号肽和胰岛素样的昆虫激素bomyxin的N端序列融合表达, 即可取得分泌形式的具有生物活性的BOM

IGF。Difalco等制备了一种BOM

IGF和IL

3的融合蛋白, 体外实验中它

可刺激正常外周血细胞中的骨髓干细胞集落形成, 体内实验结果亦显示该融合蛋白能动员具有高度增殖活性的骨髓干细胞进人外周血, 进而居住至脾脏而发挥造血功能。

细胞因子与其受体的融合蛋白 细胞因子与其受体结合时, 可增进其与其他相关分子的结合, 进而提高其生物学活性的发挥。

IL6在肝细胞的增殖中起着增强作用。IL

6Rβ(gp130)结合。可溶性IL

6和IL6Ra (gp80)的结合使其易于

6R)与IL

6结合后, 靶6Rа/gp130)

6的

和另一个受体IL细胞对IL对IL

6R蛋白(sIL

6的灵敏性增高, 并可使仅表达膜结合型IL

6R/IL

6R的细胞(IL

6起反映。在sIL6双基因转染的小鼠中, sIL6R发挥锚定IL

作用, 延长血浆IL6半衰期, 同时细胞对IL6的灵敏性显著提高。

Bcl2蛋白家族是细胞程序性死亡的重要调剂因子, BclXL是Bcl2蛋白家族中

的重要成员之一, 它能在多种类型的细胞上抑制由各类刺激所诱发的细胞死亡。粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM依托于它与GM

CSF)具有刺激粒细胞和巨噬细胞集落增加的能力, 其功能的发挥

CSF与Bcl

XL

CSF特异性受体的结合。Antonella等[5]将人GM

蛋白融合, 该融合蛋白可与人单核细胞/巨噬细胞和骨髓祖细胞的上的GM诱导其增殖, 并使Bcl

XL进入细胞抑制细胞的死亡, 加速细胞的增殖。

CSF受体结合

细胞因子与抗原融合蛋白 某些细胞因子能够招募抗原提呈细胞(APC), 增进APC 的成熟和信号转导, 调剂T细胞的功能, 从而提高机体对抗原的免疫应答。因此, 人们通过基因

融合技术, 将细胞因子与抗原融合, 使其更好的发挥基因佐剂作用。

肿瘤细胞表达的免疫球蛋白(独特型, Id)能够作为肿瘤特异性抗原, 在B细胞淋巴瘤中已证明用免疫球蛋白的可变区(即独特型)免疫动物, 可爱惜动物免受随后的肿瘤解决。Tao等从B淋巴瘤细胞(38C13)分离出Id, 将其与GM

CSF基因融合, 构建了Id与GM

CSF融合蛋白, Id的免疫原性显著增强, 可诱导出具有抗肿瘤作用的特异性抗Id抗体。随后Chen等又构建了Id IL

2和Id IL

4两种融合蛋白, 均具有比较高的免疫原性。用Id IL

4和Id GM

2融合蛋白进行免疫可产生高滴度的抗独特型抗体IgG2a和lgG3, 而Id IL

CSF融合蛋白那么无此作用。这3种融合蛋白都能诱导抗独特型抗体的产生, 且不需要载体蛋白和佐剂。杨及第等[6]构建了结核分枝杆菌的Ag85B和IL究发觉该融合蛋白具有Ag85B和IL

2嵌合基因疫苗, 研

2的双重功能活性, 二者融合后产生协同作用, 在体

12和

外增进了外周血单核细胞的增殖和Th1型细胞因子的分泌。Hitoki等[7]构建了IL鼠疫耶尔森菌F1

V融合蛋白(IL

12/F1

V, 荚膜蛋白抗原(F1

12(低表达)/F1

Ag), 毒力抗原(VV相较IL

12(低

Ag))共表达基因疫苗, 研究发觉, 用肺鼠疫攻毒后, IL表达)/F一、 IL

12(低表达)/V和IL

12(低表达)/载体(vector) DNA疫苗而言, 80%的

小鼠取得爱惜。Mark等[8]构建了豚鼠髓脂质碱性蛋白(guinea pig myelin basic protein, GPMBP; neuroantigen or NAg)的要紧致脑炎肽和白细胞介素16(IL

16)融合蛋白, 研究

16是研制致

发觉该融合蛋白是路易鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的有效抑制剂并证明IL耐受性疫苗的最正确候选细胞因子。

细胞因子与抗原融合产生的佐剂效应, 可能比游离的细胞因子产生的佐剂效应具有更多的优势。因此, 在疫苗研究中, 细胞因子作为免疫佐剂愈来愈受到人们的重视。

细胞因子与抗体融合蛋白 将抗体分子的片段与细胞因子融合, 该融合蛋白不但结合了抗体与抗原特异性结合的特性, 还具有细胞因子的多功能活性, 从而可借助抗体将细胞因子

导向到特定的靶部位, 使其高效发挥生物学功能, 减轻全身毒副作用。 IL映的重要介导分子, 也是重要的抗肿瘤细胞因子之一。在体外, IL

2是免疫反

2可促使细胞毒性T细

胞、 NK细胞及辅助T细胞增殖、 诱导产生细胞毒性的细胞因子, 诱导LAK细胞增殖。抗体IL

2融合蛋白可将IL

2靶向肿瘤灶, 提高肿瘤局部IL

2的浓度, 从而达到更好的

Fc

抗肿瘤效应, 同时也有助于减轻ILIL

2融合蛋白(C595 scFv

Fc

2的毒性。Heuser等构建了抗黏蛋白的scFvIL

2), 实验说明此融合蛋白能同时特异性地结合

MUCI+的肿瘤细胞和CD25+的免疫效应细胞。体外实验还发觉, 该融合蛋白能刺激活化的T细胞增殖, 介导静息的NK细胞对肿瘤细胞的杀伤。在免疫重建的SCID鼠黑色素瘤肝、 肺转移瘤模型中, 肿瘤特异性的融合蛋白Ch225 IL

2和 IL

2可抑制转移灶的生长, 乃至

在注射肿瘤细胞后8 d, 肿瘤己形成情形下, 也能完全消退微转移病灶。该研究说明借助抗体将细胞因子导向到肿瘤部位的免疫医治方式可有效对抗人类黑色素瘤的播散。

Reinartz等将IL6与抗独特型单克隆抗体重组, 制备了chACA125IL6融合

蛋白并将其用于卵巢癌的研究。小鼠抗独特型单抗ACA125模拟卵巢癌细胞上的CA125抗原, 可诱导抗-抗独特型抗体反映, 该反映与卵巢癌患者生存时刻呈正相关。实验结果说明: 融合蛋白接种后抗CA125(Ab3)的浓度较IL抗体的产生, 而联用情形下能够检测到抗人IL

6与chACA联用高, 且未观看到抗人IL6抗体产生。

6

IL12是介导先天免疫及细胞免疫的重要细胞因子, 具有很强的抑制肿瘤及阻止肿瘤

12关于肿瘤细胞没有直接的作用, 但IL

12能激活T细胞及

转移的活性。在体外, IL

NK细胞, 刺激CD4+ T细胞向Th1细胞分化, 后者产生的细胞因子可激活CTL 和巨噬细胞。IL

12也是血管形成的强效抑制剂, 可通过诱导IFN

γ等的分泌抑制血管形成, 进而

抑制体内肿瘤的生长。纤连蛋白(fibronectin, FN)为一种高分子量多功能糖蛋白, 是血管形成的标志, 要紧聚集于新生血管的周围, 在肿瘤的浸润事件中起重要作用。Halin等采纳抗FN的scFv L

19与IL

12融合, 发觉该融合蛋白具有壮大的抗肿瘤活性, 可致使肿瘤

组织中的T细胞、 NK细胞及巨噬细胞浸润。另外, 在鼠肿瘤肺转移动物模型中证明, 应用该融合蛋白医治比应用等量的IL

12具有更强的抗转移效应。

GMCSF能刺激造血细胞的增殖及分化, 也是一种多功能的免疫调剂因子。GM

II类分子、 粒细胞表达黏

CSF能提高各类APC的抗原提呈及增进单核细胞表达MHC附分子及刺激T细胞增殖。动物实验证明, 注射GM高抗肿瘤疫苗的爱惜效应。Helguera等将鼠GM

CSF后, 通过增强T细胞免疫, 能提CSF与HER2抗体融合, 观看到该融合

CSF

蛋白既维持了与人HER2/neu抗原的特异性结合能力, 同时也维持了与重组鼠GM

相似的生物学活性, 在小鼠体内能够明显抑制表达HER2/neu的肿瘤细胞生长, 能同时增强Th1和Th2型细胞的免疫应答。

细胞因子与毒素融合蛋白 细胞因子与毒素的融合蛋白是以细胞因子取代毒素分子的识别区域, 使毒素蛋白能选择性地杀伤含有相应细胞因子受体的靶细胞, 从而达到医治那些细胞因子引发病理性作用的疾病, 如自身免疫性疾病、 移植排斥反映等。肿瘤细胞因其恶性增殖、 缺少接触抑制的特性, 不同肿瘤细胞均有其异于正常组织细胞的受体特点, 将细胞因子与毒素蛋白融合, 可利用细胞因子作为靶向载体将细胞毒素输送到肿瘤微环境, 使该融合蛋白能选择性杀伤含有相应细胞因子受体的靶细胞, 实现靶向肿瘤的医治作用。

白喉毒素具有高效的细胞毒性, 利用其与不同的目的基因融合成的各类毒素复合物, 可对表达一些特异性受体或蛋白的细胞产生杀伤作用, 尤其是一些肿瘤细胞。体外实验说明, 白喉毒素

IL

2的融合蛋白(DAB389IL

2)对表达高亲和力IL

2受体的细胞株起毒

性作用, 而缺乏完整的高亲和力受体的细胞株(有p55亚单位而无p75亚单位)那么对该融合毒素相对耐受。Saleh等报导DAB389 IL

2在皮肤T细胞淋巴瘤(cutaneous T cell

2

lymphoma, CTCL)Ⅰ期临床实验中单独利用显示出显著的临床医治成效。DAB389IL

已成为美国食物与药品治理局(FDA)批准的临床医治药物。张建新等基于骨髓瘤、 原发性

肝癌等肿瘤细胞表面IL6受体可过度表达的事实, 用IL6 cDNA取代白喉毒素的受体

6

结合区, 构建表达了白喉毒素/IL6融合蛋白。研究说明, 此种融合蛋白对表面有大量IL受体的骨髓瘤细胞(U266)有较强的细胞毒作用而IL耐受性。

6受体较少的正常细胞对其有必然的

前列腺特异性抗原启动子(prostatespecific antigen promoter, PSPA)具有高度的

组织特异性, 仅在PSPA阳性的前列腺癌细胞中表达。Yu等构建了以人免疫缺点病毒为基础的病毒表达载体, 在该载体中使PSPA和DTA(白喉毒素A基因)基因形成融合基因。结果说明, PSPA能够高效、 特异地在前列腺癌细胞中启动DTA基因表达并产生自杀作用。体外实验说明, 它在雄激素存在的情形下能够杀死PSA阳性的前列腺癌细胞。在异种移植PSA阳性的前列腺癌细胞鼠体内实验证明, 能够使肿瘤细胞快速退化, 并使其存活时刻超过一年而没有肿瘤的进展, 但在PSA阴性的对照却没有这种成效。这一研究结果说明转染基因能够对进展的前列腺肿瘤产生医治成效。

假单胞菌外毒素A(pseudomonas exotoxin A, PE)为不可逆性蛋白合成抑制剂, 将其细胞结合域删除即为PE40, 其仅表现出极低的细胞和动物毒性。将编码TGFPE40基因融合, 其表达产物既有TGF

α的基因与

α受体结合活性又保留有PE的细胞毒性。某些肿瘤

receptor), 其配体之一即TGF

α。

如人类胰腺癌组织过度表达上皮生长因子受体(EGF

实验证明TP40这一双功能蛋白能抑制或杀伤表达高水平EGF受体的肿瘤细胞。

细胞因子与血清白蛋白融合 血清白蛋白是血浆的重要成份, 正常情形下不易透过肾小球, 体内散布极广而且没有酶学和免疫学活性, 是理想的药物载体。白蛋白融合技术具有以下优势: 白蛋白与目标蛋白在细胞内经蛋白翻译系统通过肽键连接, 不需额外的体外处置; 白蛋白的表达水平较高, 与其融合后能够提高目的蛋白的表达水平; 白蛋白是一个稳固的“惰性”蛋白, 与其融合后能够提高目的蛋白的稳固性; 白蛋白融合蛋白具有较长的药物半

衰期。如人血清白蛋白(HAS)自身在血浆中的半衰期长达19 d, 将小分子蛋白药物与HSA融合可有望提高在血液中的半衰期。目前, 多种蛋白与HSA 融合后在实验动物体内半衰期的延长取得了证明。

唱韶红等用毕赤酵母中表达的HSA一般 IFN

hIFNα2b融合蛋白在猕猴体内的半衰期约为

α的20 倍。美国马里兰州人类基因组科学(HGS)公司进行了一系列HSA融合

α融合蛋白[9]、 HSA/IFN

β 融合蛋白(albuferon

CSF 融合蛋白

蛋白质药物的研究, HSA/IFNβ)[10]、 HSA/rIL

2 融合蛋白(albuleukin)[11]、 HSA/rG

(albugranin)[12]、 HSA/rHGH 融合蛋白(albutropin)[13]都具有明显的半衰期延长作用。

3 细胞因子融合蛋白技术在兽医学领域的进展前景

细胞因子的种类繁多且每一种细胞因子的作用又具有多样性, 其在机体内环境中的彼此作用更为复杂, 因此细胞因子融合蛋白的研究几乎涵盖了所有常见的细胞因子。在功能上相关的细胞因子或分子, 其融合蛋白的生物学活性假设能够高于或等于各个组份简单相加的成效, 即具有其他单体分子无法比拟的高效性, 便有构建融合蛋白分子的意义[14]。第二, 细胞因子融合蛋白在与特定的靶向性分子结合以后, 可将有必然毒性的细胞因子选择性的、 特异性的浓集于病灶局部, 使全身性的不良反映降至最低点, 即具有某些单体细胞因子所不具有的特异性, 也是融合蛋白的研究方向之一。另外, 诸多融合蛋白虽有衍生因子的双重活性, 但其活性较野生型低或在实际应用中与衍生因子配伍不明显, 解决分子的生物学活性与毒副作用问题是细胞因子融合蛋白进展的实践需求。可是, 细胞因子融合蛋白也有其缺点, 如在重复利历时由于已产生了中和抗体而抑制了其活性的发挥。因此, 在构建细胞因子融合蛋白时, 必需慎重选择所融合的细胞因子, 而且在设计中尽可能降低分子量以减少免疫原性。

融合蛋白技术是一种很有进展潜力的生物工程技术, 在肿瘤医治研究中[15], 很多制品已进入了临床实验, 并取得了令人鼓舞的进展。目前, 有关动物细胞因子的研究也取得了迅猛进展, 一些重组细胞因子已在动物疾病的预防、 医治和诊断, 专门是在进展平安、 高效基因工程疫苗等方面显示出广漠的应用前景。相信在不远的以后, 人们能够应用细胞因子融合蛋白技术设计和取得高表达、 高活性的融合蛋白制剂, 从而为动物疾病的防控带来新的希望。

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