SDS-PAGE凝胶电泳测蛋白质分子量

SDS-PAGE凝胶电泳测蛋白质分子量

一、药剂准备

a、SDS-PAGE凝胶配制试剂：

1、30%Acr-Bis(29:1) 100ml 2、1M Tris-HCL,PH8.8 100 ml

3、10%SDS 5ml 4、Ammonium persulfate (过硫酸铵) 0.5克

先配制成10%的溶液以备用，如0.0625g/625ul无菌水。可可

5、TEMED 0.5 ml

6、1M Tris-HCL,PH6.8 15ml

b、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5X） 2ml，1ml/管，共2管

c、蛋白质分子量标准（200ul）

d、SDS-PAGE电泳液（1L）

由SDS-PAGE电泳液（粉剂）1瓶，已配置好1L在玻璃大试剂瓶中保存，可重复利用。（不宜超过两周）

e、考马斯亮染色液（250ml）

f、考马斯亮染色脱色液（500ml）

注：脱色液可按如下比例配制（按说明书）：

甲醇或者乙醇 250ml

80ml乙酸

去离子水补至 1000ml,混匀，备用。

二、器材准备

移液枪（绿色：100-1000ul, 蓝色：10-100ul, 白色：2-20ul）,不同规格的微

量进样针，电泳仪，电泳槽，烧杯，加热器，培养皿，浮子，镊子

三、SDS-PAGE 分析操作过程：

1、配制蛋白质溶液

用试管配制好0.05g/10ml的蛋白质清液。确保质量分数为3～5g/L。试管依次标号1、2、3、4、5。用保鲜膜和皮筋封口保存备用。最好当天现配。

2、制分离胶（即下胶层）

鉴于本蛋白质的最佳分离范围是10-40kD,所以SDS-PAGE分离胶浓度取15%。 按说明书“SDS-PAGE凝胶配制试剂盒”后表格。依照15%胶，5ml（打勾）一栏。如图：

注意单位，表格中以ml计，操作时用移液枪以ul计，同时注意移液枪量程。

a. 按上图配方制分离胶，迅速摇匀。

b. 安装好电泳仪，组装模具，沿着固定好的大小玻璃板形成的槽边侧分次

用移液枪迅速向槽中注入分离胶，注意勿打入气泡，高度至槽高2/3- 3/4。

c. 紧接着，用移液枪从槽上面间隔均匀地注入1000ul（即1ml）蒸馏水以

水封，目的是使分离胶凝胶上层界面平滑。

d. 在30度烘箱中静置半小时，冬天室温50min。直至分离胶与水之间出现一

条平滑光亮的界面痕迹。

3、制浓缩胶

按说明书“SDS-PAGE凝胶配制试剂盒”后表格，依照5%胶，4ml（打双勾）一栏。如图：

a. 分离胶在烘箱中10min左右后，按上图配浓缩胶，迅速摇匀。

b. 待分离胶与水之间平滑光亮的界面痕迹稳定后，抬高电泳仪一侧，用移

液枪从边缘吸出分离胶上的水，尽量吸干净。

c. 电泳仪放平稳后，沿着槽边侧分次用移液枪迅速向槽中注入浓缩胶，注

意勿打入气泡，迅速平稳地插入齿梳。 d. 在30度烘箱中静置半小时。

4、配样。用移液枪配合微量进样针，从每支试管中吸取15ul蛋白质溶液，加入

1-5号对应小样管，每支小样管中再加入1/5（3ul）的上样缓冲液。在 100℃沸水中煮 5min。

5、加电泳液及上样

小心拔出齿梳，卸下封条。将制好的凝胶用电泳架固定至电泳槽中。注：短板朝里。若只跑一块胶，电泳夹的对面也必须放置一块电泳板。倒入1L电泳液，液面至短板和长板之间。每孔上样量15ul, 即小样管中全部上样（1-5号对应）。蛋白质分子量标准上样量7ul。

6、电泳仪接线，打开电源，稳压状态下将电压调到 180v（15min 左右），待样品跑过浓缩胶后将电压调到 200v 至样品电泳到胶底部为止，整个过程1.5-2.5h。

7、关掉电泳仪电源，拆线。从电泳仪上拔出玻璃槽。打开玻璃板，将凝胶小心剥下放入容器中，加入染色液，用摇床摇 2－3h，染液可回收。

8、待条带清晰后倒出染色液，加入脱色液过夜。第二天换脱色液2-3次。脱色4 -24h。

9、将脱色液倒掉，可以用 Quality One，或者相应的成像系统拍照、分析、估 算蛋白浓度。

注：具体染色脱色等步骤见说明书。